【实验目的】

掌握变性梯度凝胶电泳检测新的突变，以及测定高度多态基因的基因型的技术方法。

【实验原理】

在现代遗传学中DNA 序列突变的分析占有十分重要的地位。由于在较大DNA 序列中检测一个细微的突变非常困难，因而现在人们建立了几种方法来解决这一难题。变性梯度凝胶电泳(DGGE)能把长度相同而核苷酸顺序不同的双链DNA 片段分开。这种方法利用了DNA 分子从双螺旋型变成局部变性型时电泳迁移率会下降的现象。不同的DNA 片段发生这种变化所需梯度不同。DGGE 的凝胶中沿电场方向变性剂(甲醛和尿素)含量递增，当DNA 片段通过这种变性剂递增的凝胶时，不同分子的电泳迁移率在不同区域会发生降低。这就可使核苷酸顺序不同DNA 片段分开。此方法可作为测序的初始步骤在杂合个体中分离等位基因。许多研究表明变性递度凝胶电泳分离能力很强，它可以把相差仅1bp 的DNA 片段分开。

【仪器、材料与试剂】

1.50×TAE 缓冲液(2mol/LTris 乙酸盐，0.05mol/L EDTA pH8.0)1L 体积：242gTris碱，57.1mL 冰醋酸，100mL 0.5mol/L EDTA pH8.0，加水至lL。

2.丙烯酰胺贮存液：40%丙烯酰胺(38:2 丙烯酰胺:双丙烯酰胺)。

3.过硫酸铵贮存液(10%)：10mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL。TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。

4.变性剂贮存液：(0%)6%丙烯酰胺TAE 溶液。250mL 溶液：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，加水至250mL，过滤和排气。

5.变性剂贮存液(100%)：6%丙烯酰胺，7mol/L 尿素，40%甲醛TAE 溶液。250mL配制：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，105g 尿素，100mL 甲醛，加水至750mL，过滤并排气。

6.染料：40%(W/V)蔗糖，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青和30%甘油。

7.塑料胶框、梳子和垫片，两个用于固定胶框中玻璃片的塑料支架。

8.一有柄和一无柄的两片玻璃板(尺寸：17.78cm 宽×20.32cm 长×0.635cm 厚)，有柄的玻璃板有一个13.97cm 宽，2.54cm 厚的突出。

9.无金属结构的塑料槽(尺寸：43.18cm 长×22.86cm 宽×22.86cm 深；可以允许一块或两块胶同时电泳)。

10.电源、阳极—铂制；阴极—石墨棒(直径0.635cm)。

11.蠕动泵及连接管、搅拌器和加热器、梯度生成器：每侧容积15～25mL。

【实验步骤】

1.制备平行胶：平行胶中从上至下变性剂的浓度递增。这种胶适用于分析大量样品。

1)与制备标准聚丙烯胺凝胶一样制备胶板。

2)从丙烯酰胺和两种变性剂贮存液中取两份等体积溶液以符合要求的变性剂浓度范围。溶液的总体积一般为刚好覆盖胶板。丙烯酰胺的浓度取决于DNA 片段的大小，对于DNA 片段大小为≥300bp 的丙烯酰胺的浓度为6%，而长度＜300bp 的DNA 片段，丙烯酰胺的浓度为12%。

3)加高浓度变性剂溶液到梯度生成器右槽中(该溶液将首先通过梯度合成器进入胶板间的空隙)，打开连接梯度生成器两端的开关，让一些溶液流入左槽内关上开关，用吸管把它们移回到右槽(目的是确保两槽之间无气泡的阻隔)。然后把低浓度变性剂溶液加到梯度生成器左槽中。

4)搅拌这两个槽中溶液的同时向其中加入4.5μL/mLl0%的过硫酸铵和1μL/mL 的TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。

5)轻轻打开两槽之间的开关及梯度生成器出口的开关，灌胶时两槽内的溶液应处于搅拌状态(尤其高浓度溶液槽更应搅拌)，溶液受重力影响通过一个放在两块玻璃板之间的顶部的细塑料管流过梯度生成器。流速应保持一定大小以保证溶液在凝聚之前所有溶液都应注入到两层玻璃板之间。(凝聚速度可通过调整过硫酸铵和TEMED 的浓度来调节)

6)胶板充满后，在其顶部插入梳子并将其放平，凝聚至少30min。(胶可事先灌好并于4℃贮存几天)。

2.制备垂直胶：垂直胶含有丙烯酰胺的浓度是固定的，垂直于电泳方向有一个线性递增的变性剂梯度。这种胶适用于确定分离含有核苷酸改变的DNA 片段的最佳梯度范围。垂直胶的制备大体相似和平行胶的制备，但也有所不同：

1)像标准的聚丙烯酰胺凝胶一样制备胶板，但其顶部不插入梳子。

2)准备一块比梳子稍短的涂上润滑剂的间隔片插在梳子的位置，位置稍突出一些，这样左边就留下一个缺口。用夹子夹紧这一边。把胶板旋转90°这样和缺口相连的这一面就转到最上面了。胶液将通过该缺口进入两玻璃板之间。如前所述的方法灌胶。

3)胶完全凝固之后，将胶板垂直立起，轻轻移出胶顶部的间隔片。胶的顶部就会出现大而平的孔，这样就可以进行电泳了。

3.DNA 电泳：(平行或垂直DGGE 的步骤是相同的)

1)移去顶部间隔片或梳子之后，将相关设备和胶移至含有加热到60℃的缓冲液的电泳槽内，使缓冲液高度刚刚没过胶上的加样孔。

2)连上蠕动泵以使缓冲液能从槽内流至顶部槽内(阴极)。之后缓冲液漫过框架边缘的小孔重新流回槽内(顶槽缓冲液循环是必须的，目的是避免电泳过程中pH 值的显著增加和离子强度的改变)。

3)对垂直胶电泳来说，向胶顶部的加样孔中加入100μL PCR 产品(其中包括20μL的上样染料)；而对于平行胶电泳来说，每个加样孔中加入15～20μL 样品。

4)按照凝胶宽度在顶槽内放置石墨电极，并根据片段的大小在150～350V 电压下电泳3～15h。在平行胶上，250V、电泳5h 可使300bp 的片段移到凝胶的1/3 处。

5)0.5μg/mL 溴化乙锭中进行染色并观察。

【注意事项】

1.在混合和灌胶时应避免产生气泡。

2.有时聚丙烯酰胺凝胶的左侧会出现缩水现象以致在胶的顶部到底部之间会产生空气通道，可用2%熔化的琼脂糖凝胶将其充满。

3.所有溶液应保存于4℃棕色瓶中，一般几个月到一年内有效。

4.电泳时凝胶温度必须保持恒定，要达到这一要求，可把胶板浸没于充分搅拌的温控缓冲液槽内。对于缺乏变性剂时比较容易变性的DNA 来说，槽内的温度选择在60℃稍微超过熔点，并且大部分的工作都在60℃下进行(但温度稍高或低一点都可采用)。温度保持恒定可将电泳缓冲液加热到60℃，并把胶浸入其中进行电泳即可。